紙層析法。色素在濾紙條上能分離的原因是四種色素隨著層析液在濾紙上的擴(kuò)散速度不同。四條色素帶從上到下依次為胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a，葉綠素b。

紙層析法原理

紙層析法依據(jù)極性相似相溶原理，是以濾紙纖維的結(jié)合水為固定相，而以有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。由于樣品中各物質(zhì)分配系數(shù)不同，因而擴(kuò)散速度不同，從而達(dá)到分離的目的。

試樣經(jīng)層析后可用比移值（Rf）表示各組成成分的位置（比移值=原點(diǎn)中心至色譜斑點(diǎn)中心的距離與原點(diǎn)中心至流動(dòng)相前沿的距離之比），由于影響比移值的因素較多，因此一般采用在相同實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)照物質(zhì)對(duì)比以確定其異同。

作為單體鑒別時(shí)，試樣所顯主色譜斑點(diǎn)的顏色（或熒光）與供置，應(yīng)與對(duì)照（標(biāo)準(zhǔn)）樣所顯主色的譜斑點(diǎn)或供試品-對(duì)照品（1∶1）混合所顯的主色譜斑點(diǎn)相同。作為質(zhì)量指標(biāo)（純度）檢查時(shí)，可取一定量的試樣，經(jīng)展開后，按各單體的規(guī)定，檢視其所顯雜質(zhì)色譜斑點(diǎn)的個(gè)數(shù)或呈色（或熒光）的強(qiáng)度。作為含量測(cè)定時(shí)，可將色譜斑點(diǎn)剪下洗脫后，再用適宜的方法測(cè)定，也可用色譜掃描儀測(cè)定。

葉綠體色素理化性質(zhì)

這二大類四種色素都不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，如乙醇、丙酮等。通常用80%的丙酮或丙酮：乙醇：水為4.5：4.5：1的混合液來提取葉綠素。

按化學(xué)性質(zhì)來說，葉綠素是葉綠酸的酯，在堿的作用下，可使其酯鍵發(fā)生皂化作用，生成葉綠酸的鹽，能溶于水，但由于它保留有Mg核的結(jié)構(gòu)，仍保持原來的綠色。而類胡蘿卜素中，胡蘿卜素是不飽和的碳?xì)浠�合物，β―胡蘿卜素水解可生成2分子維生素A，葉黃素是由胡蘿卜素衍生的二元醇，不能與堿發(fā)生皂化反應(yīng)，根據(jù)這一點(diǎn)，可以將葉綠素和類胡蘿卜素分開。

此外，葉綠素還可以在酸的作用下，其中的Mg被H所代替形成褐色的去Mg葉綠素：去Mg葉綠素能與其他金屬鹽中的銅、鋅、鐵鹽等代H，又重新呈現(xiàn)綠色，比原來的綠色更穩(wěn)定。根據(jù)這一原理可用醋酸銅處理來保存綠色標(biāo)本。